Le Labo SVT du Lycée de l’Europe

Vous êtes ici : Accueil du site > Les manips du Labo > Biologie > Une alternative à l’oxymétrie dans l’étude de l’activité enzymatique de la (...)
Par : Seb
Publié : 7 avril 2009

Une alternative à l’oxymétrie dans l’étude de l’activité enzymatique de la peroxydase du navet.

La turbidimétrie

Introduction

Les oxydations cellulaires produisent du peroxyde d’hydrogène (eau oxygénée H2O2) qui est nocif pour les cellules. Celles-ci possèdent une enzyme, la peroxydase qui utilise H2O2 pour oxyder ses substrats selon la réaction :

H2O2 + RH2 (réduit) --------------------> 2 H2O + R (oxydé)

Si RH2 est du gaïacol (ou méthoxyphénol), il va subir une oxydation qui va le faire changer de couleur. Le gaïacol réduit est incolore ; oxydé il est brun-rouge. Il est donc possible de suivre la réaction par turbidimétrie.

Manipulation

le turbidimétre est fixé sur un support et est relié à un adaptateur, ce dernier est branché sur l’interface ExAO lui même relié à un ordinateur.

voici le matériel nécessaire pour cette expérience :

- un flacon de gaïacol à 0.2%

- un flacon de jus de navet pure ( solution de peroxydase entre autres)

- 7 pilulier de 20 ml avec un cache noir pour les différentes mesures et pour l’étalonnage.

- 6 flacons avec de l’eau oxygénée à diverses concentrations : 2V ; 1V ; 0.1V ; 0.05V ; 0.02V et 0.01V

- une pissette d’eau distillée

- une pipette de 10 ml avec pro pipette

- une "poubelle"

1ère étape : étalonnage du turbidimétre avec le logiciel Sérénis

L’étalonnage et les mesures doivent se faire dans un récipient opaque (pilulier avec cache) afin qu’aucune lumière parasite ne perturbe les mesures.

1. Lancer le logiciel Sérénis, et positionner les icônes " turbidimétre 1" et "turbidimétre 2" sur l’axe des ordonnées et l’icône "temps" sur l’axe des abscisses.

2. Cliquer sur l’icône temps et entrer une durée d’acquisition de 4 minutes ( dans l’onglet " fonction du temps").

3. Verser 9 ml d’eau distillée dans un des pilulier munie de son cache noir, puis plonger le turbidimétre dans l’eau jusqu’à toucher le fond du pilulier.

4. Cliquer sur l’icône " turbidimétre 2" puis sur l’onglet "Mesure", et a l’aide du bouton gauche de l’adaptateur, afficher une valeur de 99.9%.

5. Cliquer sur l’icône "turbidimetre 1" puis sur l’onglet 3mesure", et à l’aide du bouton droit de l’adaptateur afficher la valeur 0ù

6. Enlever de l’axe des ordonnées l’icône "turbidimetre 1", maintenant inutile.

2ème étape : préparer les solutions

Verser dans les 6 piluliers qui restent :

- 4 ml de gaïacol, rincer immédiatement la pipette à l’eau distillée

- 4ml d’eau oxygénée en commençant par le pilulier qui recevra la concentration la plus faible et en suivant l’ordre croissant des concentrations ; ne pas rincer entre chaque concentration mais à la fin.

il faudra ajouter la solution de peroxydase au moment de la mesure.

3ème étape : réaliser les mesures

il faudra réaliser les mesures en commençant par la concentration la plus élevée d’H2O2 et en diminuant progressivement.

1. Mettre en place le turbidimètre afin qu’il touche le fond du pilulier, tout en prenant soin de laisser de la place en avant de la sonde pour pouvoir introduire la seringue.

2. Préparer 1 ml de peroxydase dans la seringue, puis lancer la mesure en cliquant sur le feu vert.

3. Injecter l’enzyme 20 secondes après le début de la mesure, rapidement et contre la paroi du pilulier.

4. A la fin de la mesure, retirer et rincer la sonde à l’eau distillée.

5. Mettre en place le turbidimétre dans le pilulier suivant et recommencer les mêmes opérations.

les injections d’enzymes seront effectuées avec un décalage de 20 secondes à chaque fois, par rapport à la mesure précédente, ( c’est a dire : première injection à 20 secondes, 2ème à 40, 3ème à 60 sec, etc)

Une fois toutes les mesures réalisées , rincer les piluliers et la sonde, ranger et essuyer la table !

4ème étape : déterminer les vitesses initiales de la réaction.

1. Faire un clique droit sur le graphique et sélectionner "Tangente"

2. A l’aide du clic gauche, le logiciel trace une tangente à la courbe sélectionnée.

3. En déplaçant la souris, on déplace le point de la courbe sur lequel la tangente est tracée, il faut donc déplacer ce point non pas à l’origine de la courbe, mais au point d’injection de l’enzyme ; relever alors le coefficient directeur de la courbe qui correspond en fait à la vitesse initiale de la réaction.

4. Recommencer pour les différentes concentrations ( il faut désélectionner la première tangente pour pouvoir sélectionner la tangents suivante)

Resultats obtenus format .doc :

Word - 109.5 ko

Resultats obtenus format .LAB ( format pour atelier scientifique) :

Zip - 23.3 ko